人血紅蛋白u（HBM）ELISA Kit

本試劑盒僅供研究使用。

                   BES6793K

96T

產品檢測范圍:1.56ng/ml-100ng/ml

檢測原理

博爾森生物生產的 ELISA 試劑盒采用“夾心法”:將捕獲抗體包被于酶標板上，捕獲樣品及標 準品中的靶蛋白，生物素化的檢測抗體與靶蛋白結合， SABC 復合物與生物素化檢測抗體結 合，形成免疫復合物，加入 TMB 顯色液后，若反應孔中有靶蛋白則顯藍色，加入終止液變黃 色，檢測過程中游離的成分均被洗去，用酶標儀在 450 nm 處測 OD 值，靶蛋白濃度與 OD 值之 間呈正比，通過繪制標準曲線計算出標本中靶蛋白的濃度。

按操作順序形成抗體夾心結構后，加入TMB 底物，板孔液體由無色變成藍色，再加入終止液 液體變為黃色后進行吸光度值測定。

雙抗體夾心模式圖

標本收集及試劑準備:

1、樣品預處理 

下面列出的樣品收集和儲存條件旨在作為一般性指導。樣品穩定性尚未評估。 

a) 細胞培養上清液：在 1000×g 下離心 15 分鐘去除顆粒，立即進行測定或等分裝樣品，并 將樣品儲存在≤-20℃的溫度下。避免重復凍融循環。（細胞培養上清液樣品建議 2 倍稀 釋。例如：100μL 樣品+100μL 的 1×稀釋液）

b) 血清：使用血清分離管，使樣品在室溫下凝結 30 分鐘，然后在 1000×g 下離心 15 分鐘。 立即取出血清并進行測定或等分裝樣品，將樣品儲存在≤-20℃的溫度下。避免重復凍融 循環。（血清樣品建議 2 倍稀釋。例如：50μL 樣品+50μL 的 1×稀釋液） 

c) 血漿：使用 EDTA 或肝素作為抗凝劑收集血漿。收集后 30 分鐘內，以 1000×g 離心 15 分 鐘。立即測定或等分裝樣品，并將樣品儲存在≤-20℃的溫度下。避免重復凍融循環。 （血漿樣品建議 2 倍稀釋。例如：50μL 樣品+50μL 的 1×稀釋液）注：檸檬酸鹽抗凝劑 血漿未經驗證可用于本試驗，使用時應自行驗證可行性。溶血的樣品不適合用于該測定。 

d) 組織勻漿：用預冷的 PBS(0.01M,pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液（勻漿中裂解的紅細胞 會影響檢測結果），稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對應體積的 PBS（一般按 1:9 的 重量體積比，比如 1g 的組織樣品對應 9mL 的 PBS，具體體積可根據實驗需要適當調整， 并做好記錄。推薦在 PBS 中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨或 勻漿機研磨。為了進一步裂解組織細胞，可以對勻漿液進行超聲破碎，或反復凍融。最 后將勻漿液于 5000×g 離心 5-10 分鐘，取上清檢測。 

e) 細胞裂解液：貼壁細胞用預冷 PBS 輕輕清洗，然后用胰蛋白酶消化，1000×g 離心 5 分鐘 后收集細胞；懸浮細胞可直接離心收集。收集的細胞用預冷 PBS 清洗 3 次，每 1×106 個 細胞中加入 150-200μL 的 PBS 重懸（推薦在 PBS 中加入蛋白酶抑制劑；若含量很低可適 當減少 PBS 體積）并通過反復凍融或超聲使細胞破碎。將提取液于 2-8℃，1500×g 離心 10 分鐘，取上清檢測。 

f) 其它樣本類型：1000×g 離心 20 分鐘，取上清即可檢測。 

2、洗滌液/稀釋液配置 

如果洗滌液/稀釋液（20×）有晶體析出，需在 37℃下加熱?晶體全部溶解。用蒸餾水 1:20 稀釋（例如：1mL 濃縮洗滌液/稀釋液加入 19mL 的蒸餾水） 

3、標準品配置 

取 8 個 1.5ml 離心管，分別標注 S1,S2,S3,S4,S5,S6，S7，blank，第一管 S1 中加入標準品/ 樣品稀釋液 900ul，第二至第八管中分別加入標準品/樣品稀釋液 200ul，在第一管中加入標 準品溶液（10000ng/mL ）100ul 置于漩渦混合器上混勻后用加樣器吸出 200ul，移至第二 管，如此反復作對倍稀釋至 S7，第八管為空白對照。配置好的標準曲線濃度為:100、50、25、 12.5、6.25、0ng/ml（標準品的用量及標準曲線范圍也可根據自己需要配置）。

4、生物素化抗體工作液配置 

使用前 20 分鐘，用生物素化抗體稀釋液將 100×生物素化抗體稀釋成 1×工作液，根據所需 用量配置，當日使用，剩余棄之。 

5、SABC 工作液配置 

使用前 20 分鐘，用 SABC 稀釋液將 100×SABC 稀釋成 1×工作液，根據所需用量配置，當日 使用，剩余棄之 

6、如果您檢測的樣本中靶蛋白濃度高于標準品最高值，建議重新檢測，請根據實際情況，適 當倍數稀釋(建議做預實驗，以確定稀釋倍數)。

注意事項

1．操作嚴格按照說明書進行，本試劑不同批號組分不得混用。

2．試劑盒從冷藏環境中取出應在室溫平衡15-30分鐘后方可使用，酶標包被板開封后如未用完，板條應裝入密封袋中保存。

3．濃洗滌液可能會有結晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結果。

4． 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。

5．底物請避光保存。

6．試驗結果判定必須以酶標儀讀數為準，使用雙波長檢測時，參考波長為630nm

7．所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理。終止液為2M的硫酸，使用時必須注意安全。

保存條件及有效期

1．試劑盒保存：；2-8℃。

2．有效期：6個月